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影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的因素有哪些?

 更新時間:2024-04-08 點(diǎn)擊量:1832

隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷發(fā)展,細(xì)胞轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為研究真核細(xì)胞基因功能的常規(guī)工具。常用于研究基因功能、基因表達(dá)調(diào)控、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物學(xué)試驗中,其應(yīng)用非常廣泛。既然細(xì)胞轉(zhuǎn)染如此重要,那影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的因素有哪些?讓我們一起來看看吧!

一、轉(zhuǎn)染試劑

不同細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率通常不同,因此在轉(zhuǎn)染實驗前需要根據(jù)細(xì)胞特性選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑。可以通過已發(fā)表文獻(xiàn)和轉(zhuǎn)染試劑提供的已成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株來進(jìn)行選擇。

二、細(xì)胞狀態(tài)

轉(zhuǎn)染前細(xì)胞活力和總體健康狀況是轉(zhuǎn)染產(chǎn)生變異性的重要來源。一般建議在轉(zhuǎn)染前至少24小時進(jìn)行傳代培養(yǎng),以確保細(xì)胞在傳代后處于轉(zhuǎn)染的最佳生理條件,細(xì)胞活力大于 90%。最shi合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是復(fù)蘇經(jīng)過幾次傳代后達(dá)到指數(shù)生長期的細(xì)胞,細(xì)胞生長旺盛,最容易轉(zhuǎn)染。為確保轉(zhuǎn)染的重復(fù)性,一般選擇低細(xì)胞代次(<30,能確?;蛐筒蛔儯?。如果發(fā)現(xiàn)同一株細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率降低,可以嘗試重新復(fù)蘇細(xì)胞以恢復(fù)最佳結(jié)果。此外,污染會嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)染結(jié)果。

三、匯合度

轉(zhuǎn)染時過高或者過低的細(xì)胞密度會導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低,乃至表達(dá)水平偏低。因此要根據(jù)具體的細(xì)胞類型、應(yīng)用和轉(zhuǎn)染技術(shù),來優(yōu)化確定相應(yīng)的最佳密度。如使用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染時,貼壁細(xì)胞一般達(dá)到 70%-90% 的匯合度,懸浮細(xì)胞達(dá)到 5 × 105 2 × 106 個細(xì)胞/mL 的密度,即可獲得良好的結(jié)果。但不同的轉(zhuǎn)染試劑,針對不同細(xì)胞系要求轉(zhuǎn)染時的最適細(xì)胞密度各不相同,因此使用新的細(xì)胞系或者新的轉(zhuǎn)染試劑時,應(yīng)進(jìn)行實驗優(yōu)化并建立一個穩(wěn)定方法,包括適當(dāng)?shù)慕臃N量和培養(yǎng)時間等等。不同實驗?zāi)康囊矔绊戅D(zhuǎn)染時的鋪板密度,比如研究細(xì)胞周期相關(guān)基因等表達(dá)周期長的基因,就需要較低的鋪板密度,所以需要選擇能夠在較低鋪板密度下進(jìn)行轉(zhuǎn)染的試劑。

四、培養(yǎng)基

不同的細(xì)胞或細(xì)胞類型都有非常特定的培養(yǎng)基、血清、補(bǔ)充劑要求,選擇最shi合細(xì)胞類型的培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)染方法在轉(zhuǎn)染實驗中起著非常重要的作用。一些細(xì)胞系和原代細(xì)胞可能需要特殊的包被材料(如多聚賴氨酸、膠原蛋白、纖連蛋白等)以附著于培養(yǎng)板并獲得最佳的轉(zhuǎn)染結(jié)果。

五、血清

一般培養(yǎng)基中存在血清可增強(qiáng) DNA 轉(zhuǎn)染。但使用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染時,一些血清蛋白會干擾復(fù)合物的形成,因此應(yīng)在無血清條件下制備DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。當(dāng)使用 RNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞時,建議在無血清條件下轉(zhuǎn)染,以避免潛在的RNase污染。

六、抗生素

一般用于瞬時轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基中可含抗生素。不過,由于陽離子脂質(zhì)體試劑可增加細(xì)胞通透性,因此也可能增加遞送到細(xì)胞內(nèi)的抗生素量,從而導(dǎo)致細(xì)胞毒性以及較低的轉(zhuǎn)染效率。因此不建議在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入抗生素??稍谵D(zhuǎn)染前鋪板細(xì)胞時,使用無抗生素的培養(yǎng)基。

對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,不應(yīng)在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素,因為這些抗生素是 Gibco Geneticin 選擇性抗生素的競爭性抑制劑。在構(gòu)建穩(wěn)定的細(xì)胞系時,在轉(zhuǎn)染程序后預(yù)留 48-72 小時供細(xì)胞表達(dá)抗性基因,之后再加入選擇性抗生素。

七、轉(zhuǎn)染分子類型

質(zhì)粒 DNA 是最chang用的轉(zhuǎn)染載體。質(zhì)粒 DNA 的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(線性或超螺旋)和大小會影響轉(zhuǎn)染的效率,超螺旋質(zhì)粒 DNA 瞬時轉(zhuǎn)染的效率zui高。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染中,相對于超螺旋 DNA,雖然使用線性 DNA 會導(dǎo)致細(xì)胞的 DNA 攝取量較低,但 DNA 整合到宿主基因組中的效果更優(yōu)。雖然寡核苷酸、RNAsiRNA 和蛋白質(zhì)等其他大分子也可以轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中,但在使用這些大分子時,需要優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。

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